Clínica Universitaria Reina Fabiola, Córdoba, Argentina
Resumen
En pacientes con diagnóstico de oligodendroglioma (OD) y oligoastrocitoma (OA) la presencia de la codelección 1p19q presenta valor pronóstico y predictivo y se encuentra presente en alrededor del 50% de los casos. La técnica FISH (fluorescence in situ hybridization) es el método estándar para su evaluación. La técnica CISH (chromogenic in situ hybridization) es una alternativa y fue validada en otras neoplasias. Se analizaron las características histológicas de los pacientes con diagnóstico de OD y OA y su correlación con la codelección 1p19q detectada por CISH. En 3 de los 24 pacientes analizados (13%) se encontró la presencia de la codelección 1p19q. Sólo encontramos la codelección en aquellos con diagnóstico de OD grado II. No fue encontrada la mutación en ningún caso en: OD grado III y OA grado II y III. La frecuencia de detección de la codelección (13%) es inferior a la descripta en otros estudios que utilizaron la técnica de FISH. Las posibles causas de esta discordancia pueden atribuirse a que la cantidad de pacientes es insuficiente para validar el método, a errores en el procesamiento del material o en su lectura, o bien a que el método de CISH no es coincidente con FISH.
Palabras clave: oligodendroglioma, oligoastrocitoma, delección, FISH, CISH
Abstract
In oligodendroglioma (OD) and oligoastrocytoma (OA), the 1p and 19q deletion has prognostic value in survival. It is also a predictive factor for response to chemotherapy. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is the standard method for its evaluation. Chromogenic in situ hybridization (CISH) could be an alternative that has already been validated in other neoplasias. In OD and OA, this combined deletion is present in about 50% of patients when analyzed with FISH. Paraffin-embebed tumor tissue was analyzed for 1p19q deletions by CISH. The results were correlated to the histology (OD and OA) and grade (II and III) of the tumors. The 1p and 19q deletion was found in 3 of the 24 patients analyzed (13%). The combined deletion was only found in those with grade II OD. No combined deletion was found in patients diagnosed of grade III OD and grade II and III OA. The detection of the combined deletion with CISH technique was inferior (13%) than the literature. We cannot demonstrate that CISH is a reliable method for the detection of the 1p and 19q deletion. The possible reasons of this difference could be attributed to the number of patients of the study, to deviations in the procedures of the test or to the fact that the CISH method is not coincident with FISH.
Key words: oligodendroglioma, mixed oligodendroglioma astrocytoma, deletion, FISH, CISH
Introducción
Los gliomas malignos dan cuenta de aproximadamente el 70% de las neoplasias malignas primarias del sistema nervioso central (SNC). La incidencia anual de gliomas malignos es de alrededor de 5 casos cada 100.000 personas. Los glioblastomas representan el 60 a 70% de los gliomas y los astrocitomas anaplásicos el 10 a 15%1.
Los oligodendrogliomas (OD) conforman el 10% de los gliomas del SNC y constituyen el 2.7% de los tumores de cerebro. Otro 5% de los gliomas son gliomas mixtos u oligoastrocitomas (OA) y representan el 1.3% de los tumores de cerebro1, 2. Puede observarse que son tumores poco frecuentes.
Los OD y OA son clasificados en 2 grados: grado II y grado III o anaplásico. La definición del grado es establecida por las características histológicas y el índice de proliferación Ki-67 (MIB-1), el cual es habitualmente bajo en los OD y OA grado 2 (< 5%) y mayor en la variante anaplásica3, 4.
Las anormalidades citogenéticas son un atributo característico de las células cancerosas. En la actualidad, se han encontrado aberraciones cromosómicas clonales en todos los tipos tumorales y muchas de ellas han emergido como marcadores pronósticos y predictivos en neoplasias hematológicas y ciertos tumores sólidos. Su importancia radica, asimismo, en que estas anormalidades genéticas pueden ser usadas para identificar subpoblaciones de pacientes que pueden beneficiarse de una terapéutica específica (terapias blanco)5.
Los OD representan la primera neoplasia del SNC en la cual una alteración genética demostró ser factor pronóstico en la supervivencia. A la fecha, se demostró mejoría en la supervivencia en aquellos pacientes que presentan la delección simultánea de los cromosomas 1p y 19q3. La codelección es el resultado de una translocación no balanceada del cromosoma 19p al 1q2.
La codelección 1p19q se encuentra presente en más del 50% de los OD y OA6. Se demostró que la presencia de la codelección no solo está asociada de manera estadísticamente significativa al pronóstico sino que es además predictora de respuesta luego de quimioterapia con agentes alquilantes7-11.
La técnica FISH es el método estándar para la evaluación de la codelección 1p19q. Sin embargo, FISH es una técnica costosa y requiere instrumental específico (microscopio de fluorescencia) y entrenamiento experto para su interpretación adecuada12.
Por otro lado, la técnica CISH se presenta como una alternativa práctica. Esta técnica se basa en reacciones enzimáticas y para su desarrollo se necesitan sólo microscopios ópticos comunes. Además, la interpretación para el patólogo es más simple. Asimismo, en comparación con FISH, los resultados del CISH pueden ser archivados para consultas futuras sin pérdida de la intensidad de señal12.
Una ventaja adicional del CISH es que restringe el estudio directamente a las células neoplásicas, dado que el examen morfológico de las células puede llevarse a cabo al mismo tiempo con técnica de hematoxilina-eosina13. Al permitir la caracterización morfológica simultánea, la técnica de CISH permite valorar también la heterogeneidad tumoral12.
En los últimos años, la técnica de CISH ha adquirido relevancia dado su poder para evaluar deleciones y amplificaciones de genes, aneuploidías cromosómicas y translocaciones cromosómicas13.
La técnica de CISH ha sido validada como un método económico, práctico y adecuado para la detección de la amplificación del oncogén HER-2 en cáncer de mama y es ampliamente usado en la práctica diaria13-15. CISH se presenta también como una alternativa para la determinación del número de copias del gen de EGFR en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas16. Algunas comunicaciones preliminares también sugieren su utilidad en la detección de la amplificación del gen EGFR en gliomas12, 13.
Dadas las ventajas enumeradas de esta técnica y su validez probada en otras enfermedades, el objetivo de este estudio fue investigar la utilidad de la técnica CISH para la detección de las delecciones 1p y 19q en pacientes con diagnóstico de OD/OA.
Materiales y métodos
Se trata de un estudio retrospectivo, longitudinal, observacional, cuyos objetivos son conocer la frecuencia de la codelección 1p19q analizada por CISH en pacientes con diagnóstico de OD y OA, y las características clínicas e histológicas de los pacientes con diagnóstico de OD y OA y su relación con la codelección 1p19q detectada por CISH.
Se incluyeron pacientes de ambos sexos, con diagnóstico de oligodendroglioma u oligoastrocitoma confirmado por histología, desde el año 2006 al año 2010.
Se excluyeron aquellos en los que no se pudo realizar el análisis de la codelección 1p19q por técnica de CISH.
Se analizaron las historias clínicas de la Clínica Universitaria Reina Fabiola de los pacientes diagnosticados con OD y OA entre los años 2006 y 2010. Se obtuvieron los datos clínicos y epidemiológicos.
Se analizaron los informes de anatomía patológica de los pacientes con diagnóstico de OD y OA a partir del año 2006 hasta el año 2010 y se obtuvieron los datos de variedad histológica, grado de diferenciación y marcador de proliferación Ki 67.
Evaluación del estado de 1p y 19q: CISH: Técnica: Se realizó sobre cortes tisulares (4 – 5 μm de espesor) fijados en formalina e infiltrados en parafina (FFPE). Cada corte tisular fue desparafinado en xileno, alcohol, agua destilada y luego calentado a 98° C durante 15 minutos con solución de pretratamiento para calor. A continuación se realizó la técnica de digestión enzimática a temperatura ambiente. Luego se deshidrató en una serie graduada de alcoholes, se secó al aire y se le agregó la sonda específica al tejido en estudio. Las sondas específicas usadas fueron SPOT-Light® Sonda Cromosoma 1p36 de Zymed (84-3000) y SPOT-Light® Sonda Cromo- soma 19q de Zymed (84-2600).
Posteriormente se desnaturalizó a 94 °C. La hibridización se realizó durante más de 10 horas a 37 °C. Se trató el preparado con solución tampón SSC. Luego se realizó la inmunodeteción con CAS-block, HRP estreptovidina, diaminobencidina (DAB) y contrateñido con hematoxilina. Se examinaron los resultados de la hibridización utilizando un microscopio de campo luminoso con objetivo 40x.
Las células diploides normalmente tienen dos señales del cromosoma 1p36 y dos señales del cromosoma 19q (Figuras 1 y 2). Se consideró el resultado de la siguiente manera:
- Normal (sin codelección): cuando fueron detectadas 2 copias en > 50% de las células neoplásicas.
- Deleccionados: cuando fueron detectadas < 2 copias en > 50% de las células neoplásicas.
- Aneuploide: cuando fueron detectadas 3-5 copias en > 50% de las células neoplásicas.
Todos los procedimientos estuvieron de acuerdo con lo estipulado en la Declaración de Helsinki, Las Guías de Buenas Prácticas Clínicas en Investigación en Seres Humanos de ANMAT, la Ley Provincial 9496/09 y sus respectivas disposiciones.
Resultados
Se analizaron 24 pacientes con diagnóstico histológico de OD y OA.
La mediana de edad al diagnóstico fue de 36 años. El rango de edad fue entre 7 y 53 años. El 83% de los pacientes tenían entre 30 y 50 años cuando fueron diagnosticados.
Respecto del sexo, en el 62 % de los casos fueron mujeres.
En cuanto a los síntomas que llevaron al diagnóstico, el 50% (n = 12) de los casos se manifestaron inicialmente con convulsiones. En 25% (n = 6) el síntoma de presentación fue cefalea. En 1 (4%) se manifestó a partir de disfasia. El 17% (n = 4) fueron hallazgos en estudios de imágenes (asintomáticos). En uno de los casos no se pudo obtener información de la historia clínica. Respecto de la localización del tumor, el sitio más común de presentación fue en lóbulo frontal (54%) (n = 13), seguido del lóbulo temporal con 33% (n = 8). En 2 casos se localizaron en el lóbulo parietal y en el caso restante en el ángulo pontocerebeloso.
Del total de casos analizados, el 71% (n = 17) fueron OD. El 29% (n = 7) restante fueron OA.
El 35% de los OD correspondieron a la variedad anaplásica (grado 3), en tanto que el 29% de los OA fueron grado 3.
Se realizó el análisis de la codelección 1p19q en los 24 pacientes mediante la técnica de CISH. En 3 de los 24 (13%) se encontró la presencia de la codelección (Figura 3).
En el 100% (n = 3) con resultado positivo para la codelección 1p19 q, la variedad histológica correspondiente fue OD grado 2.
En cuanto al grado histológico en aquellos con diagnóstico de OD no codelecionados, el 57% fue grado 2, en tanto que el 43% restante correspondió a la variedad anaplásica (grado 3) (Figura 4). En el caso de los OA sin codelección, la variante anaplásica estuvo presente en el 29% y el 71% restante fue grado 2 (Figura 5).
En cuanto al valor del marcador de proliferación Ki67 en pacientes sin codelección, el 62% fue mayor o igual al 5%.
En relación al tratamiento recibido, los 3 pacientes con codelección recibieron terapia concurrente con RT y QT con temozolomida. Dos recibieron terapia concurrente luego de diagnóstico por biopsia estereotáxica, ambos con respuesta completa. El caso restante fue tratado con resección quirúrgica completa y a la recaída, fue tratado con radioquimioterapia concurrente, también con respuesta completa. En los 21 pacientes restantes (sin codelección), la elección del tratamiento fue muy variada. En 13 (62%) pacientes se realizó cirugía con resección completa, en 4 (19%) resección parcial y en 3 (14%) pacientes el diagnóstico se realizó por biopsia estereotáxica.
Luego, dependiendo del tratamiento inicial (resección quirúrgica parcial, resección completa o biopsia estereotáxica), las características del paciente y la elección del médico, los pacientes recibieron tratamiento radiante, QT o terapia concurrente. De manera general, el 71% recibió RT y el 43% recibió QT.
Discusión
El presente estudio analizó el resultado de la codelección de los cromosomas 1p y 19q mediante la técnica de CISH, en los pacientes con diagnóstico de OD y OA se correlacionaron estos resultados con las características histopatológicas de los mismos. La importancia de la disponibilidad de la detección de la codelección 1p19q por medio de un método sencillo, validado y económico, radica en que se ha demostrado que su resultado positivo (presencia de la codelección) presenta implicancias tanto pronósticas como predictivas de respuesta al tratamiento. En el estudio fase III de RTOG 9402, los pacientes con diagnóstico de OD fueron aleatorizados a QT con agentes alquilantes asociado a RT secuencial vs. RT sola; la supervivencia en ambos grupos fue similar; sin embargo, en los pacientes con codelección 1p19q la supervivencia fue mayor, independientemente de la rama de tratamiento (factor pronóstico). En un análisis no pre-planeado, se demostró además ventajas en la supervivencia libre de progresión en aquellos pacientes con codelección tratados con agentes alquilantes8. Los resultados a largo plazo de dicho trabajo, presentados en ASCO 2012, demostraron que aquellos pacientes con tumores que presentaban la codelección 1p19q tenían una supervivencia media mayor luego de ser tratados con PCV [procarbazina, CCNU (lomustine) y vincristina] y RT que aquellos tratados con RT sola [14.7 vs. 7.3 años, HR 0.59, 95% CI (0.37, 0.95), P = 0.03]. No hubo diferencia en supervivencia según esquema de tratamiento en aquellos pacientes con tumores sin la codelección 1p19q. Por tanto, la codelección 1p19q es considerada tanto pronóstica como predictiva de respuesta a agentes alquilantes10.
En un segundo estudio fase III del EORTC, los pacientes fueron aleatorizados a recibir QT con agentes alquilantes o no, inmediatamente posterior a RT. Aquellos con la delección alélica combinada presentaron mejoría en la supervivencia, independientemente del tratamiento recibido9. Los resultados a largo plazo de este estudio, presentados en ASCO 2012, demostraron también que la codelección 1p19q no sólo es un factor pronóstico positivo sino también un factor predictivo de respuesta a QT11.
En relación a las características demográficas, en coincidencia con la bibliografía, más del 80% de los pacientes del estudio fueron diagnosticados en dicho rango de edad (30 – 50 años). Según la revisión de Jaeckle y col.2 la mayoría de los pacientes con diagnóstico de OD de bajo grado ocurren en pacientes de entre 30 y 50 años. Los tumores de alto grado tienden a ocurrir a una edad algo mayor2. En el estudio de Cairncross y col.8 la mediana de edad fue de 43 años y el 69% eran menores de 50 años. En el trabajo de van den Bent y col. la mediana de edad fue de 49 años9.
Entre los pacientes con diagnóstico de OD y OA existe un predominio de sexo masculino en la mayoría de los trabajos2,17,18. Sin embargo, en el presente trabajo, menos del 40% de los casos fueron masculinos. En el estudio de Shaw y col.17, el 58% de los OD y OA grado II ocurrieron en pacientes de sexo masculino. En el trabajo de Buckner y col. el 54% correspondían al sexo masculino18.
En relación a la forma de inicio, en coincidencia con la literatura2,7, la forma más común de presentación fue síndrome convulsivo (50%). También en coincidencia con la bibliografía, el sitio más frecuente en que se localizó fue en el lóbulo frontal (54%), seguido del lóbulo temporal. En el estudio de Brandes y col.7, que estudió la codelección 1p19q como factor predictor de respuesta a temozolomida en OD anaplásicos y recidivados, el sitio más frecuente de localización fue el lóbulo frontal (59.7%) y el 56.7% tenía antecedente de convulsiones. En la revisión de Jaeckle y col.2, la forma de presentación de OD y OA se corresponde en más del 70% con convulsiones.
Alrededor del 50% de los pacientes con OD/ OA presentan la codelección cromosómica 1p19q, detectada por técnica de FISH7,9,17,18. En el presente trabajo, sólo 13% presentó la codelección cuando fue analizada por técnica de CISH. En el estudio de van den Bent del EORTC9 la delección combinada 1p19q se observó en el 25%, delección 1p en el 15% y delección 19q en el 12%. En el estudio fase III del RTOG previamente citado8, la delección alélica combinada se observó en el 47% de los pacientes estudiados (n = 289). En el trabajo de Brandes y col.7, la codelección fue observada también en el 47% (n = 67) de los pacientes con OD y OA, ambos grado III.
En relación a la variedad histológica, se ha descripto a la codelección en el 83% con diagnóstico de OD grado 2, 63% de los OD grado 3, 56% de los OA grado 2 y 52% de los OA anaplásicos2,17. Estos resultados fueron publicados en la revisión de OD que analizaba distintos marcadores moleculares como predictores de respuesta2. En el estudio de Smith y col.19, la presencia de la codelección 1p19q se observó en el 39% de los OD y 21% de los OA primarios, en tanto que se encontró la delección combinada en 56% de los OD recidivados y el 33% de los OA recurrentes.
En nuestro caso, sólo encontramos la codelección en aquellos pacientes con diagnóstico de OD grado 2. Además, en sólo 3 (27%) de los 11 pacientes con diagnóstico de OD grado 2 se encontró la codelección. No se encontró la mutación en ningún caso en las otras 3 variantes histológicas.
De los 21 pacientes en los que no se detectó la codelección, el 65% fue grado 2 en el caso de los OD y el 71% fue grado 2 en la variedad OA.
Por tanto, si bien las características de los pacientes (edad, localización, forma de presentación) coinciden con las relatadas en la bibliografía, no encontramos coincidencia en la detección de la codelección 1p19q mediante la técnica de CISH, siendo los porcentajes de detección inferiores a los descriptos en otros trabajos que usan la técnica de FISH para la detección de mutación.
Por tanto, no podemos demostrar la utilidad del CISH para la detección de la codelección 1p19q en pacientes con OD/OA.
La expresión por inmunohistoquímica (IHQ) del neurofilamento intermedio internexina alfa (INA) se asoció con la presencia de la codelección 1p19q. Así, en un análisis retrospectivo del estudio EORTC 26951, se demostró una fuerte asociación entre la expresión de INA y la presencia de la delección alélica combinada. La expresión de INA se asoció a una mejoría en la supervivencia independientemente del tratamiento recibido y podría tener impacto en la eficacia de QT combinada con RT20. Por tanto, dicha proteína surge como una nueva alternativa a ser valorada en estudios futuros.
En relación a las limitaciones del CISH, este método exige un procesamiento de varios pasos que requiere formación especializada en la selección de los reactivos apropiados, selección de tejidos, fijación, procesamiento, preparación del porta CISH e interpretación de los resultados de la tinción. La tinción de los tejidos y de las células depende del manejo y procesamiento de la muestra del tejido antes de la tinción. La contra tinción excesiva o incompleta puede comprometer la correcta interpretación de los resultados. Cualquier desviación de los procedimientos puede invalidar los resultados. Asimismo, pueden producirse resultados falsos positivos por la unión no inmunológica de proteínas.
Respecto a las causas de la discordancia en la detección de la codelección por el método de CISH usado en el presente estudio respecto del FISH, ésta no puede ser atribuida a diferencias en las características de la población, dado que como se describió previamente, la población del presente trabajo presenta similitudes con la descripta en la bibliografía. Las posibilidades restantes de estas diferencias pueden ser arrogadas a que la cantidad de pacientes analizados sea insuficiente para validar el método, a errores en el procesamiento del material o en su lectura, o bien a que el método de CISH no sea el adecuado para la detección de la codelección 1p19q.
Este trabajo presenta como limitación no haber comparado directamente ambas técnicas, FISH y CISH, para la detección de la mutación, así como también el número total (n = 24) de pacientes analizados.
Conflictos de interés: Los autores no tienen conflictos de interés para declarar
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