Servicio de Oncología, Sanatorio Boratti, Laboratorio de Biotecnología Molecular, Instituto de Biotecnología de Misiones, Posadas, Misiones, Argentina

 

Resumen

El cáncer de mama (CM) es uno de los más frecuentes en Argentina y primera causa de muerte por cáncer en mujeres. Las metaloproteasas son endopeptidasas que degradan la matriz extracelular, facilitando la invasión tumoral y las metástasis. Se observó la utilidad de la MMP-9 como un marcador diagnóstico, pronóstico y de seguimiento en pacientes con CM. La MMP-11 parece tener un efecto dual en cáncer, su aumento se asocia a un incremento de tumores primarios de mama, pero con una represión en el desarrollo de metástasis. En el trabajo se analizaron los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) Arg574Pro del gen MMP-9 y Ala38Val del MMP-11, con relación a las metástasis de CM. Se tomaron muestras de sangre de pacientes con CM metastásico y no metastásico (controles), con receptores de progesterona+, estrógeno+ y HER2-neu+/-. Se extrajo ADN de 25 muestras y se diseñaron cebadores para amplificar la región que contenían los SNPs Arg574Pro y Ala38Val. Se estandarizó la PCR para los SNPs correspondientes, aclarando que el cebador izquierdo que amplifica Arg574Pro, hibrida sobre los polimorfismos rs146961494 y rs35691798. Se realizó el análisis de las enzimas de restricción, MbiI para Arg574Pro y AatII para Ala38Val. Se concluye que para MMP-9, el polimorfismo presenta el alelo C como el G sólo en el grupo metastásico. En cuanto al gen MMP-11, se encuentra en alta frecuencia la variante alélica T, la cual no corresponde al alelo ancestral, indicando que puede estar su función/expresión relacionada con el carcinoma mamario. Estos hallazgos son preliminares.

Palabras clave: cáncer de mama, metástasis, metaloproteasas, MMP9, MMP11, SNPs

 

Abstract

Breast cancer (BC) is one of the most common in Argentina and the leading cause of cancer death in women. Metalloproteases are endopeptidases that degrade the extracellular matrix, facilitating tumor invasion and metastases. The utility of MMP-9 was observed as a diagnostic, prognostic and follow-up marker in BC patients. MMP-11 appears to have a dual effect on cancer. High levels are associated with an increase in primary breast tumors, but with repression in the development of metastases. Arg574Pro SNPs of the MMP-9 gene and Ala38Val of MMP-11 gene were analyzed in relation to BC metastases. Blood samples were taken from patients with BC metastatic and non-metastatic (controls), with progesterone+, estrogen+ and HER2-neu+/- receptors. DNA from 25 samples was drawn and primers were designed to amplify the region containing the SNPs Arg574Pro and Ala38Val. PCR was standardized for the corresponding SNPs, clarifying that the Arg574Pro amplified left primer hybridizes to polymorphisms rs146961494 and rs35691798. The restriction enzyme analysis was performed, MbiI for Arg574Pro and AatII for Ala38Val. It is concluded that for MMP-9, the polymorphism presents the C allele as the G only in the metastatic group. As for the MMP-11 gene, the allelic variant T is found in high frequency, which does not correspond to the ancestral allele, indicating that its function/expression may be related to mammary carcinoma. These findings are preliminary.

Key words: breast cancer, metastases, metalloproteases, MMP9, MMP11, SNPs

 

Introducción

La invasión es una característica común a casi todos los tumores malignos. En algunos de ellos, las células neoplásicas invaden el tejido vecino precozmente, esto conlleva a la migración de las células malignas a órganos distantes, fenómeno denominado metástasis1. La migración celular esta mediada por mecanismos de señalización, así como por la secreción de factores autócrinos y parácrinos dados por la activación de células estromales en el microambiente del tejido mamario2. El mismo está compuesto por matriz extracelular (MEC), células como fibroblastos y macrófagos, entre otras3.

La degradación de la MEC es crucial para el crecimiento tumoral maligno, invasión, metástasis y angiogénesis2. En la progresión tumoral, la disrupción de las barreras naturales está vinculada con enzimas proteolíticas de la MEC, como lo son las metaloproteasas (MMPs). Las mismas son endopeptidasas expresadas por las células estromales que permiten a las células neoplásicas invadir los tejidos2,4. Sin embargo, no todas están involucradas en la progresión de la carcinogénesis, como es el caso de la MMP-8 que se ha establecido como un gen supresor de tumores5.

Las MMPs son secretadas en forma latente y requieren el ion Zn2+ o Ca2+ en su sitio activo para llevar a cabo su función proteolítica, siendo inhibidas por los inhibidores tejidos-específicos de metaloproteasas (TIMPs). Las MMPs están constituidas por al menos 25 endopeptidasas, estas enzimas están codificadas por 24 genes en humanos y se las divide en 5 grupos: gelatinasas, matrilisinas, estromalisinas, colagenasas instersticialesyMMPdemembrana(MT-MMP)2,5.

La expresión de las MMPs es inducida por una variedad de estímulos externos tales como citosinas, interferones, interleucinas, factor de crecimiento (FGF), factor de necrosis tumoral–alfa (TNF-α) o beta (TNF-β), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y el inductor de MMPs de matriz extracelular (EMPRIN) (Extracellular Matrix Metaloproteinase Inducer)6.

Existe una clasificación molecular en base a los perfiles de expresión con diferencias entre tumores positivos o negativos para receptores de estrógeno (ER),progesterona(PR)y receptor del factor de crecimiento epidermal humano-2 (HER2)7.

Las variaciones heredadas en una sola base (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) representan el 90% de la diversidad fenotípica humana, pudiendo alterar la expresión proteica. En este sentido, en los genes MMP-9 y MMP-11, existen SNPs que podrían llevar a una alteración en la expresión o función de estas proteasas en la MEC, degradando la misma y favoreciendo a las células tumorales la invasividad8.

En el CM metastásico se ha observado un incremento de las MMP-9 y 11. La MMP-9 pertenece al grupo de las gelatinasas, cuya actividad proteolítica está dirigida contra el colágeno intersticial desnaturalizado9,10. La MMP-9 o gelatinasa-B es débil o ausente en los tejidos normales, y se encuentra limitada a monocitos y macrófagos. Sin embargo, su expresión puede ser inducida en caso de remodelación tisular, como sucede durante el desarrollo embrionario. Actualmente, se ha observado que se encuentra involucrada en el proceso de la metástasis en asociación con la transición epitelio mesénquima (TEM), este complejo mecanismo de la progresión está asociado a la producción de fibroblastos específicos productores de MMP-94.

La MMP-11, pertenece al grupo de la estromalisinas. En estudios llevados a cabo en cánceres de mama humanos se ha informado que los fibroblastos del estroma que rodeaban a las células tumorales, no las células neoplásicas mismas, son responsables de producir las estromalisinas11. Una posible explicación a este fenómeno fue el hallazgo del inductor de MMP de la MEC (EMMPRIN).

Los genes que codifican para las metaloproteasas de interés están ubicados en los loci 20q11.2-q13-1 para MMP912 y 22q11.2-22q11.23 para MMP1113.

Basándonos en la frecuencia alélica y en la región del gen afectada, seleccionamos de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), los SNPs Arg574Pro del gen MMP-9 y Ala38Val del MMP-11.

El objetivo general del trabajo es analizar los SNPs Arg574Pro (rs2250889) del gen MMP-9 y Ala38Val (rs738792) del MMP-11, con relación a las metástasis del cáncer de mama.

 

Materiales y métodos

Se utilizaron muestras extraídas mediante punción venosa de pacientes con cáncer mamario. Se tomaron criterios de selección: receptor estrógeno+, con un valor de corte ≥ 50; receptores de progesterona y HER2-neu positivo o negativo; además, separando los pacientes en dos grupos: metastásicos y no metastásicos. Este trabajo fue aprobado por un comité de bioética. Todas las muestras fueron clasificadas con un código para preservar la identidad del paciente y la información obtenida es confidencial siguiendo las reglamentaciones éticas, legales y jurídicas establecidas en las normas bioéticas nacionales.

Extracción de ADN14 (modificación de salting–out): se realizaron lavados sucesivos con buffer de lisis de glóbulos rojos (Tris–HCl 10mM, Tritón X 100 1% y sacarosa 11%). Se colocó al pellet en buffer de lisis de glóbulos blancos (Tris–HCl 10mM, NaCl 400mMyEDTA2mM),proteinasaKySDS.Se dejó 1h a 65oC y se adicionó acetato de potasio 3M, luego se precipitó el ADN con isopropanol y se lavó con etanol al 70%. Se conservó el ADN en agua destilada libre de ADNasas y a -20oC.

Diseño y selección de cebadores (primers): se utilizó las bases de datos NCBI, de las cuales se obtuvieron los registros de los SNPs de los genes MMP-9 y MMP-11. Se diseñaron los cebadores para las regiones que incluyeran los SNPs Arg574Pro (rs2250889) del gen MMP-9 y Ala38Val (rs738792) del MMP-11, con el programa Primer315. Se utilizaron las secuencias con el código de acceso del GenBank para MMP- 9 NC_000020.10 y para MMP-11 NC_000022.10.

Puesta a punto de la PCR: se estandarizaron las condiciones de PCR a partir de un volumen final de 20μl en 1X de buffer y 0.5 U de Taq polimerasa. Se trabajó con un rango de 1.5 y 6mM de cloruro de magnesio; entre 50 y 200 μM de dNTPs; y entre 0.5 y 0.25 μM de cada primer. El ciclado constó de una etapa inicial de 3 minutos a 94oC, seguidos de 30 ciclos de amplificación, con un período de desnaturalización a 94oC por 30 segundos, de hibridación (Tm) variable para la puesta a punto y de extensión a 72oC por 30s, con un período final de extensión a 72oC por 5 minutos. Posteriormente, se verificaron los resultados en geles de agarosa 2% teñidos con bromuro de etidio. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un equipo termociclador MultiGENE II Thermal Cycler (TC 020A-230V), los primers utilizados fueron sintetizados por OPERON (Technologies, Alemania). Además, se realizó el análisis de las enzimas de restricción que detectan los SNPs seleccionados para cada gen con los programas Clone manager Versión 4.01 y Custer (disponible on-line).

Determinación de los SNPs: mediante la técnica RFLP-PCR, para la digestión enzimática utilizamos la enzima de restricción MbiI para el SNPs rs2250889 del gen MMP-9 y la AatII para rs738792 del MMP-11. En ambos casos se probaron distintos tiempos de incubación y volúmenes de PCR para optimizar. Se realizaron geles de poliacrilamida al 10% en buffer TBE 0.5X teñidos con nitrato de plata. Posteriormente, se correlacionó las secuencias obtenidas de los individuos con el patrón de corrida.

 

Resultados

Obtención de muestras y extracción de ADN: se obtuvieron 25 muestras de punción venosa de pacientes diagnosticadas con cáncer mamario. En la Tabla 1 se muestran las características clínicas y patológicas de las pacientes y los controles utilizados para la extracción de ADN. Las mismas se clasificaron en los siguientes grupos:

  1. receptores ER+ y PR+, Her2- metastásico: 11
  2. receptores ER+ y PR+, Her2+ metastásico: 5
  3. receptores ER+ y PR-, Her2- no metastásico: 1
  4. receptores ER+ y PR+, Her2- no metastásico: 6

El rango de edad observado para no metastásicas fue de 49 a 75 y metastásicas de 38 a 80.Delas 25 muestras se observan 16 de ellas (Figura 1), con una cantidad apreciable de ADN óptimo para amplificación.

 

 

 

Tabla 1. Características clínicas y patológicas de los pacientes con cáncer de mama y controles

Diseño de cebadores: para ello se tuvo en cuenta que el %GC esté dentro de 40 a 60%, la Tm de ambos cebadores no presentan una diferencia mayor a 5ºC, y las complementariedades se encuentran dentro de los rangos óptimos15,16. Se obtuvieron cebadores específicos para el exón 10 del gen MMP-9. En el caso del gen MMP-11, se diseñaron cebadores para el exón 2 en donde se encuentra el SNP Ala38Val.

Condiciones de PCR: para la optimización de las condiciones de amplificación se tuvo en cuenta la concentración de cloruro de magnesio, el cual afecta en la especificidad de la reacción. En la Tabla 2 se observan las concentraciones utilizadas para la amplificación de los genes MMP-9 y MMP-11 y de su ciclado en la Tabla 3. La primera combinación de cebadores para MMP-9 en algunas casos amplificaba y en otros no, consultando la base de datos dbSNP de NCBI se encontró que el cebador izquierdo hibridaba con dos polimorfismos. Por esta razón, se diseñó otro cebador izquierdo.

En la Figura 2A se observa las amplificaciones obtenidas para ambos genes en estudio, observándose la estandarización de un fragmento de 215pb para el gen MMP-11 y para el MMP-9 de 222pb, aunque también existen bandas inespecíficas. En todos los ensayos se incorporaron controles negativos para cada par de cebadores. En la Figura 2 se observan los fragmentos obtenidos con la segunda combinación de cebadores para MMP-9.

 

Tabla 2. Concentraciones óptimas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

 

Tabla 3. Condiciones de ciclado para el gen MMP-11 y MMP-9

 

Figura 2. Amplificaciones de los fragmentos de los genes de MMP-9 y MMP-11

 

Para la técnica RFLP-PCR se utilizaron las enzimas de restricción MbiI para el SNP rs2250889 de MMP-9 y AatII para rs738792 de MMP-1117. Para ambas enzimas se utilizaron las mismas condiciones descriptas por el proveedor. Se obtuvieron amplicones de 267pb para MMP-9 y de 215pb para MMP-11. La incubación se realizó a 37o entre 1-16h, para la inactivación se utilizó 65o 20 min y se guardó a -20oC. Luego de realizar la digestión, los fragmentos fueron corridos en geles de poliacrilamida (Figura 3 A y B).

Las frecuencias genotípicas obtenidas para el SNP de MMP-9 para los individuos metastásicos fue: CC=0.52, CG=0.13, GG=0.04; para individuos no metastásicos fue: CC=0.30 (Tabla 4). Las frecuencias genotípicas obtenidas para el SNP de MMP-11 para el grupo metastásico fue de: CC=0.04, CT=0.30, TT=0.35; para el grupo no metastásicos: CT=0.09; TT=0.22 (Tabla 5).

 

Figura 3. Fragmentos obtenidos de la digestión enzimática

 

Tabla 4. Genotipos encontrados por grupo de pacientes

 

Tabla 5. Genotipos encontrados por grupo de pacientes

 

Discusión

El cáncer de mama es un problema de salud mundial, es el cáncer más común en todo el mundo ubicándose como la quinta causa principal de muerte relacionada con el cáncer18. En Argentina es uno de los tipos más frecuentes y primera causa de muerte, con un promedio de 19.386 de nuevos casos y 5.600 muertes por año, según el Instituto Nacional del Cáncer. La existencia de polimorfismos en el promotor del gen de MMP-9 afecta la expresión, la habilidad para degradar el tejido conectivo y la progresión tumoral19. Uno de ellos es el SNPs rs3918242 (-1562) ubicado en la región promotora, el cual influencia la expresión de MMP-9. Esto ocurre debido a que en la región promotora del gen se produce la transición del alelo C por el alelo T (-1562). En esta región se encuentra un elemento regulador importante, que parece ser un sitio de unión para una proteína represora de la transcripción. Por lo tanto, la sustitución C> T en el sitio polimórfico suprime la interacción ADN-proteína, resultando en una mayor actividad del promotor19,20.

En estudios anteriores se ha observado que el aumento de la expresión MMP-11 estaría correlacionada con características clínicas más agresivas21. Se han detectado cerca de 71 SNPs en el gen MMP-1122, se ha estudiado en cáncer gástrico23,24, sugiriendo que MMP-11 contribuye a un fenotipo tumoral más agresivo y participa en la supresión de la apoptosis celular mediante la activación de la vía p42/p44 MAP-quinasa25.

Del análisis de los resultados se desprende que para el polimorfismo Arg574Pro (rs2250889) del gen MMP9, en algunos casos se encontró el alelo ancestral C con mayor frecuencia; sin embargo, el alelo G sólo se encontró en el grupo de pacientes con metástasis. En cuanto al polimorfismo Ala38Val (rs738792) del gen MMP-11 se observó que se encuentra en alta frecuencia la variante alélica T, la cual no corresponde al alelo ancestral, indicando que este SNPs podría estar afectando la expresión y función de la proteína MMP-11 en relación con el carcinoma mamario. Interpretamos nuestros resultados coherentes con las conclusiones de otros informes que mencionan al gen MMP-9 y MMP-11 y su relación con la metástasis en CM. Estos hallazgos son preliminares, para poder corroborar se ampliará el estudio con un mayor número de pacientes y se comparará con controles, es decir, una población que no desarrolle cáncer.

En conclusión, el estudio nos podría ayudar a comprender la importancia clínica de las variantes génicas de MMP-9 y MMP11 en la mama de pacientes de mal pronóstico y podría en un futuro ayudar a identificar individuos con riesgo de desarrollar cáncer de mama.

Conflicto de intereses: Ninguno para declarar

 

Bibliografía

1. Chin D, Boyle GM, Kane AJ, et al. Invasion and metastasis markers in cancers. Br J Plast Surg 2005; 58: 466-74.
2 Angosto Cascales M, Álvarez Gómez JA. Metaloproteinasas, matriz extracelular y cáncer. An R Acad Nac Farm 2010; 76: 59-84.
3. Maller O, Martinson H, Schedin P. Extracellular matrix composition reveals complex and dynamic stromal-epithelial interactions in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2010; 15: 301-18.
4. Radisky ES, Radisky DC. Matrix metalloproteinase- induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2010; 15: 201-12.
5. López-Otín C, Palavalli LH, Samuels Y. Protective roles of metalloproteinases: from mouse models to human cancer. Cell Cycle 2009; 8: 3657-62.
6. Beridze Vaktangova N. Tesis doctoral: Identificación de factores biológicos asociados con la afectación del ganglio centinela y/o los ganglios no centinelas en el cáncer de mama, 2014. En: http://digibuo.uniovi.es/dspace/handle/10651/29990; consultado el 24/7/2017.
7. Chacón RD, Costanzo MV. Triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res 2010; Suppl 2: S3.
8. Zhang B, Beeghly-Fadiel A, Lu W, et al. Evaluation of functional genetic variants for breast cancer risk: results from the Shanghai breast cancer study. Am J Epidemiol 2011; 173: 1159-70.
9. Turpeenniemi-Hujanen T. Gelatinases (MMP-2 and–9) and their natural inhibitors as prognostic indicators in solid cancers. Biochimie 2005; 87: 287-97.
10. DeClerck YA. Interactions between tumour cells and stromal cells and proteolytic modification of the extracellular matrix by metalloproteinase in cancer. Eur J Cancer 2000; 36: 1258-68.
11. Sternlicht MD, Bissett MJ, Werb Z. The matrix metalloproteinase stromelysin-1 acts as a natural mammary tumor promoter. Oncogene 2000; 19:1102-13.
12. St Jean PL , Zhang XC, Hart BK, et al. Characterization of a dinucleotide repeat in the 92 kDa type IV collagenase gene (CLG4B), localization of CLG4B to chromosome 20 and the role of CLG4B in aortic aneurysmal disease. Ann Hum Genet 1995; 59: 17-24.
13. Levy A, Zucman J, Delattre O, Mattei MG, Rio MC, Basset P. Assignment of the human stromelysin 3 (STMY3) gene to the q11.2 region of chromosome 22. Genomics 1992, 13: 881-3.
14. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: 1215.
15. Rozen S, Skaletsky HJ. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In S. Misener and S. A. Krawetz (eds). Methods in molecular biology, vol. 132: Bioinformatics methods and protocols. Totowa, New Jersey, USA: Humana Press, 2000, pp 365-86.
16. Claros Díaz MG, Ávila Sáez C, Cánovas Ramos FM. Biología aplicada: diseño experimental y análisis de datos. Asturias: Septem Ediciones, 2001, pp 294.
17. Zavalla Castro JE. Manual de técnicas básicas de Biología Molecular. Yucatán: Universidad Autónoma de Yucatán, 2005, pp 195.
18. Zhang X, Jin G, Li J, Zhang L. Association between four MMP-9 polymorphisms and breast cancer risk: a meta- analysis. Med Sci Monit 2015; 21: 1115-23.
19. Chiranjeevi P, Spurthi KM, Rani NS, et al. Gelatinase B (-1562C/T) polymorphism in tumor progression and invasion of breast cancer. Tumor Biol 2014; 35: 1351-6.
20. Glebauskiene B, Liutkeviciene R, Vilkeviciute A, et al. Does MMP-9 gene polymorphism play a role in pituitary adenoma development? Dis Markers 2017; 2017: 5839528.
21. Cheng CW, Yu JC, Wang HW, et al. The clinical implications of MMP-11 and CK-20 expression in human breast cancer. Clin Chim Acta 2010; 411: 234-41.
22. Ban JY, Kim SK, Kang SW, Yoon KL, Chung JH. Association between polymorphisms of matrix metalloproteinase 11 (MMP-11) and Kawasaki disease in the Korean population. Life Sci 2010; 86: 756-9.
23. Deng H, Guo RF, Li WM, Zhao M, Lu YY. Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 2005; 326: 274-81.
24. Skoglund J, Emterling A, Arbman G, Anglard P, Sun XF. Clinicopathological significance of stromelysin-3 expression in colorectal cancer. Oncology 2004; 67: 67-72.
25. Formigué O, Louis K, Wu E, et al. Active stromelysin-3 (MMP-11) increases MCF-7 survival in three-dimensional Matrigel culture via activation of p42/p44 MAP-kinase. Int J Cancer 2003; 106: 355-63.

 

Share This