Instituto Alexander Fleming, Biomakers, Laboratorio de Patología Molecular, Buenos Aires, Argentina

 

Resumen

En el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), la activación de ALK se produce por la formación de genes de fusión. El perfil clínico donde ocurre con más frecuencia corresponde a pacientes jóvenes, mayormente mujeres, no fumadores, histología de adenocarcinoma y ausencia de mutaciones de EGFR y KRAS. Su presencia se describe en el 3-10% de los CPCNP.

La importancia de la determinación de ALK radica en que identifica un subgrupo de pacientes con un comportamiento biológico diferente, en los cuales el tratamiento con inhibidores específicos, como el crizotinib, ceritinib o alectinib, es más eficaz que los convencionales. Las alteraciones moleculares de ALK pueden identificarse por hibridación in situ (ISH), por inmunohistoquímica (IHQ) y por RT-PCR, aunque el FISH es el procedimiento diagnóstico de referencia a nivel clínico.

Se examinaron 308 casos de CPCNP y se compararon los resultados por FISH e IHQ. De los 8 (3%) identificados con expresión positiva, sólo 6 presentaron el rearreglo de ALK. Se presentan dos casos clínicos con ALK positivo por IHC y FISH negativo, uno presentó respuesta al tratamiento dirigido y otro no. A pesar de que el FISH es el gold standard, se acepta el uso de IHQ ya sea para definir conducta como único test o para screening y ulterior confirmación por FISH en los casos positivos. Estos dos casos con distinta respuesta al tratamiento con IHQ positiva pero FISH negativo, indican la ausencia de pautas, requiriendo de más conocimiento en el futuro para optimizar las conductas médicas.

Palabras clave: cáncer de pulmón de células no pequeñas, hibridación in situ por fluorescencia, inmunohistoquímica

 

Abstract

In non-small cell lung cancer, ALK activation is produced by gene fusion. The clinical scenario where this type of tumor appears more frequently is in young, female patients, without smoking history, adenocarcinoma histology and with no EGFR or KRAS mutation. It is described as 3 to 10% of non- small cell lung cancer cases.

The importance of ALK determinations lies in the identification of a subgroup of patients with a different biological behavior and sensible tumor to target therapy with ALK inhibitors. Molecular alterations of ALK can be determined by in situ hybridization, immunohistochemistry (IHC) and RT-PCR, FISH is the reference diagnostic procedure in clinical applications.

Were evaluated 308 cases of non-small cell lung cancer, and FISH and IHC results were compared. Eight (3%) cases presented positive expression, but only 6 of them presented ALK rearrangements. These two clinical cases of patients with IHC positive but FISH negative for ALK are presented, observing good clinical response in only one of them. Although FISH is considered the gold standard technique, IHC use is accepted for treatment decisions as a lone procedure or as screening with FISH confirmation in positive cases. These two particular cases express the absence of guidelines in this infrequent scenario, needing more knowledge in the future in order to take better medical decisions.

Key words: non-small cell lung cancer, fluorescent in situ hybridization, immunohistochemistry

 

Introducción

La alteración del gen anaplastic lymphoma kinase (ALK) fue descripta por primera vez en 1989 al identificarse una translocación recíproca entre los cromosomas 2 y 5 en un grupo seleccionado de pacientes con linfoma1. Posteriormente, se describió que esta translocación creaba un gen de fusión al combinar el extremo 5’ del gen de la nucleofosmina con la región 3’ de la quinasa. El gen ALK se localiza en el cromosoma 2 y codifica para un receptor transmembrana de la familia de los receptores de insulina y con homología con los receptores tirosina quinasa2.

El receptor de ALK está formado por un dominio extracelular con un péptido señal amino-terminal, un dominio intracelular con un segmento yuxtamembranoso, donde se encuentra el lugar de unión para el sustrato-1 del receptor de insulina, y un dominio carboxi-terminal. Su activación produce la dimerización del receptor y transmisión de la señal al interior celular3. A pesar de su importancia terapéutica, su función fisiológica no está claramente definida.

Las alteraciones de este receptor están implicadas en diversos tipos de tumores, entre los que se incluyen linfomas no Hodgkin, rabdomisosarcomas, neuroblastomas, carcinomas tiroideos anaplásicos y pulmonares.

En el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), la activación de ALK se produce por la formación de genes de fusión4. La fusión de ALK más frecuente es con el gen EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4), que codifica una proteína citoplasmática involucrada en la formación de microtúbulos. Se genera una inversión del brazo corto del cromosoma 2 [Inv (2) (p21p23)] que une los exones 1–13 de EML4 a los exones 20 –29 de ALK. La inversión cromosómica no siempre ocurre en la misma localización, por lo que se pueden formar diversas variantes, aunque todas las fusiones incluyen siempre el dominio intracelular con actividad tirosina quinasa de ALK codificada en el exón 20. A pesar de que la alteración de EML4 puede localizarse en diferentes sitios, el dominio aminoterminal es necesario y suficiente para generar la actividad transformante oncogénica. En el CPCNP se han identificado más de trece variantes de EML4- ALK, siendo las más frecuentes la E13;A20 en 33% de los casos y E6a/b;A20 en 29%. Por otro lado, pueden darse fusiones de ALK con otros genes como TFG-11 y KIF5B5.

Todos estos reordenamientos generan una activación constitutiva del receptor ALK, mediante el cual se activan vías intracelulares en las que estarían involucradas ERK y STAT3.

El perfil clínico donde ocurren con mayor frecuencia los tumores de pulmón con fusión de ALK corresponde a pacientes jóvenes, mayormente mujeres, no fumadores, histología de adenocarcinoma y ausencia de mutaciones de EGFR y KRAS. Dentro de los adenocarcinomas son más comunes los patrones de tipo sólido- cribiforme, papilar o micropapilar y es muy característica la presencia de células en anillo de sello6. No obstante, se han descrito casos de alteración de ALK en todos los tipos de CPCNP, por lo que los rasgos clínicos o patológicos no deben ser los únicos indicadores para realizar el estudio que detecte la translocación7. La presencia de reordenamientos de ALK puede estar entre el 3 y el 10% de los CPCNP8.

La importancia de la determinación de ALK radica en que identifica un subgrupo de enfermos con cáncer de pulmón con un comportamiento biológico diferente, en los cuales el tratamiento con inhibidores específicos ofrece mayor eficacia que los tratamientos convencionales, como sucede en los pacientes con tumores EGFR mutados. En octubre de 2010 se publicaron los primeros resultados con la experiencia de crizotinib, un inhibidor dual de ALK y MET, en 82 pacientes con presencia de reordenamientos de ALK9. Se observó una tasa de respuesta del 57% y un control de la enfermedad en el 90%. En la publicación final de este estudio, fueron incluidos 149 pacientes que alcanzaron una tasa de respuesta del 60.8% (IC95% 52.3-68.9)10. Esta respuesta era independiente de la edad, género, estado general o línea de tratamiento. La mediana de supervivencia libre de progresión fue de 9.7 meses (IC95% 7.7-12.8) y la supervivencia a un año fue del 74.8% (IC95% 66.4-81.5). Posteriormente, un ensayo clínico fase III demostró la mayor actividad de crizotinib sobre quimioterapia con cisplatino y pemetrexed en primera línea (PROFILE 1014)11. El espectro de drogas que actúan a este nivel ha ido creciendo a lo largo de los años y en la actualidad existen otras dos drogas aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA) que tienen a ALK como target y que han demostrado eficacia en distintos escenarios: ceritinib y alectinib.

Las alteraciones moleculares de ALK pueden identificarse por hibridación in situ (ISH), por inmunohistoquímica (IHQ) y por RT-PCR. El ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular, Des Plaines, IL) y el VENTANA ALK (D5F3) CDx Assay son las pruebas diagnósticas aprobadas por la FDA para el tratamiento target.

El FISH es el procedimiento diagnóstico de referencia a nivel clínico. Para definir una muestra como positiva, tiene que existir más de un 15% de células tumorales con señales divididas, en una muestra de al menos 60 células. El análisis por FISH presenta desafíos técnicos, incluyendo la inestabilidad de la señal y dificultades en el score. Consecuentemente, es un test que a pesar de ser el método de elección puede presentar falsos positivos y negativos.

La IHQ podría utilizarse como un método de screening inicial. Esta técnica emplea anticuerpos dirigidos contra la porción más distal del dominio tirosina quinasa de ALK, que se encuentra conservada en todos los reordenamientos y que constituye la parte activa de la molécula. La mayor parte de casos positivos presentan una tinción citoplasmática granular intensa y homogénea a lo largo del tumor, mientras que se considera un resultado negativo cuando hay ausencia total de tinción o una positividad muy débil. Se debe recordar el riesgo de resultados falsos negativos inherente a esta metodología y el alto valor predictivo positivo de las nuevas IHQ ultrasensibles, que harían innecesaria la confirmación posterior con FISH12.

Se examinaron 308 casos de CPCNP y se compararon los resultados por FISH e IHQ. De los 8 (3%) de los casos identificados con expresión positiva, sólo 6 presentaron el rearreglo de ALK. La evaluación de ALK por IHQ fue realizada con el Ventana anti-ALK (D5F3) Rabbit monoclonal antibody (Roche, CE-IVD) usado en combinación con el OptiView DAB IHC Detection kit y OptiView Amplification Kit como una prueba de IHQ automatizada en el Ventana BenchMark XT slide stainer. ALK por FISH fue realizado usando el Vysis ALK Break Apart Probe kit (2p23/ALK translocation detection, Abbott, CE-IVD).

Se presentan dos pacientes con ALK positivo por IHQ y FISH negativo y diferentes respuestas clínicas a la terapia dirigida.

 

Caso clínico1

Hombre de 54 años con antecedentes de dislipemia, hipertensión y tabaquista de 30 p/a, bajo tratamiento con amlodipina y atorvastatina. En octubre de 2015 comenzó con tos y febrícula vespertina, por lo que el 30/11/2015 se realizó TAC de tórax que presentó masa con invasión de mediastino y arteria pulmonar, compromiso de grupos ganglionares 5, 6 y 7. Se realizó biopsia de adenopatía supraclavicular izquierda que evidenció adenocarcinoma moderadamente diferenciado. Completó la estadificación el 28/12/2015 con PET, presentando hipercaptación de FDG en masa pulmonar del lóbulo inferior izquierdo, ganglios supraclaviculares bilaterales, mediastino bilateral e imagen retroperitoneal (pilar izquierdo del diafragma) interpretándose como estadio IV. Inició tratamiento de quimioterapia con cisplatino 75 mg/m2 y pemetrexed 500 mg/m2, y luego del primer ciclo se recibió resultado de ALK+ por IHQ, por lo que se decidió rotar a crizotinib que inició el 2/2/2015. A la semana de tratamiento se internó por disnea con derrame pleural masivo izquierdo, requiriendo decorticación por VATS y sellado pleural. Posteriormente, se informó resultado de ALK por FISH, el cual fue negativo.

El 12/3/2015 se realizó la primera tomografía de evaluación de respuesta que mostró progresión ganglionar y pulmonar, por lo que se indicó quimioterapia con cisplatino 75 mg/m2 y pemetrexed 500 mg/m2.

Caso clínico 2

Mujer de 61 años con antecedentes de depresión y tabaquista de 18 p/a, bajo tratamiento con escitalopram y clonazepam. En noviembre de 2015 una radiografía, que luego se completó con tomografía computada, mostró una masa en el lóbulo inferior izquierdo e imagen ganglionar satélite. Se ampliaron los estudio con PET que evidenció SUV elevado en grupos ganglionares 6, 7 y 11 y nódulos pulmonares periféricos sospechosos de metástasis no hipercaptantes (SUV 1.4). Se realizó biopsia, en la anatomía patológica se informó un adenocarcinoma semidiferenciado con compromiso de pleura parietal y mediastinoscopía con compromiso de los ganglios 5 y 6. En la biopsia se observó translocación de ALK por IHQ pero con resultado de FISH negativo. Se decidió iniciar tratamiento con crizotinib.

En un control de toxicidad se informó trastorno visual y epigastralgia, por lo que se suspendió el tratamiento transitoriamente, y se reinició a los 5 días.

Al momento de la evaluación, mostró respuesta parcial con disminución del volumen tumoral y mejoría clínica (Figuras 1 y 2).

Figura 1. Corte tomográfico sagital del Caso 2 mostrando: (A)lesiones tumorales al momento del diagnóstico y (B) su respuesta parcial luego del tratamiento con crizotinib

 

Figura 2. Corte tomográfico axial del Caso 2 mostrando: (A) lesión tumoral al momento del diagnóstico y (B) su respuesta parcial luego del tratamiento con crizotinib

 

Discusión

Numerosos estudios compararon las técnicas de IHQ y FISH13, indicando diversos rangos de precisión diagnóstica. Utilizando al FISH como gold standard, la IHQ muestra una sensibilidad que oscila entre 90-95% y especificidad entre 97- 100%. Como en los casos descriptos previamente, otros autores han notado que pacientes con FISH negativo pueden beneficiarse del tratamiento dirigido a este target. En un trabajo, el 32% de los pacientes detectados por Next generation sequencing fueron negativos por FISH, de los cuales el 55% mostró respuesta al crizotinib, poniendo en tela de juicio el rol de este método como gold standard14.

Un estudio con 3128 casos de CPCNP analizados mediante FISH e IHQ con Ventana-D5F3 demostró la presencia de patrones por FISH negativos o atípicos que se acompañaban de IHQ positiva15. Lo más valioso del trabajo es el hallazgo de pacientes con fusiones de EML4-ALK bajo rearreglos complejos no detectados por FISH pero positivos por IHQ, que podrían potencialmente beneficiarse del tratamiento con crizotinib. El FISH definido por los entes reguladores, puede no detectar importante rearreglos en ALK por la existencia de numerosas variantes y la específica definición del patrón positivo. Sus autores recomiendan el estudio combinado de rutina y el uso de métodos de confirmación como RT-PCR o Next generation sequencing para optimizar los resultados y la selección de pacientes candidatos a tratamientos.

A pesar de que el FISH es el gold standard actualmente, para detectar pacientes ALK positivos se acepta el uso de IHQ, ya sea para definir conducta como único test o para screening y ulterior confirmación con FISH en los casos positivos. Estos dos casos con distinta respuesta al tratamiento con IHQ positiva pero FISH negativo, indican la ausencia de pautas en este escenario poco frecuente, requiriendo de más conocimiento en el futuro para optimizar las conductas médicas.

 

Bibliografía

1. Le Beau MM, Bitter MA, Larson RA, et al. The t(2;5) (p23;q35): a recurring chromosomal abnormality in Ki-1- positive anaplastic large cell lymphoma. Leukemia 1989; 3: 866-70.
2. Iwahara T, Fujimoto J, Wen D, et al. Molecular characterization of ALK, a receptor tyrosine kinase expressed specifically in the nervous system. Oncogene 1997; 14: 439–49.
3. Souttou B, Carvalho NB, Raulais D, Vigny M. Activation of anaplastic lymphoma kinase receptor tyrosine kinase induces neuronal differentiation through the mitogen-activated protein kinase pathway. J Biol Chem 2001; 276: 9526-31.
4. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature 2007; 448: 561-6.
5. Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry- based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res 2009; 15: 3143-9.
6. Nishino M, Klepeis VE, Yeap BY, et al. Histologic and cytomorphologic features of ALK-rearranged lung adenocarcinomas. Mod Pathol 2012; 25: 1462-72.
7. Thunnissen E, Bubendorf L, Dietel M, et al. EML4-ALK testing in non-small cell carcinomas of the lung: a review with recommendations. Virchows Arch 2012; 461: 245-57.
8. Sasaki T, Jänne PA. New strategies for treatment of ALK- rearranged non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res 2011; 17: 7213-8.
9. Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2010; 363: 1693-703.
10. Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patientswith ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol 2012; 13: 1011-9.
11. Solomon BJ, Mok T, Kim DW, et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. N Engl J Med 2014; 371: 2167-77.
12. Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association
for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol 2013; 8: 823-59.
13. McLeer-Florin A, Moro-Sibilot D, Melis A, et al. Dual IHC and FISH testing for ALK gene rearrangement in lung adenocarcinomas in a routine practice: a French study. J Thorac Oncol 2012; 7: 348-54.
14. Ali SM, Ou S-HI, He J, et al. Identifying ALK rearrangements that are not detected by FISH with targeted next-generation sequencing of lung carcinoma. J Clin Oncol 2014; 32(suppl): 8049a.
15. Li W, Zhang J, Guo L, Chuai S, Shan L, Ying J. Combinational Analysis of FISH and Immunohistochemistry Reveals Rare Genomic Events in ALK Fusion Patterns in NSCLC that Responds to Crizotinib Treatment. J Thorac Oncol 2017; 12: 94-10

 

 

Share This